对近年来高通量培养技术在质量源于设计(QbD)驱动下的研究进展与应用进行了阐述，重点对一些从DNA到大规模生产的放大过程中能够缩短培养时间并广泛应用于工业生产的高通量培养技术进行了详细介绍。这些技术主要包括微孔板(MTP)培养、微型生物反应器、平行发酵系统等，并对这些平台的优缺点进行了详细讨论。此外，还对一些新兴的微型生物反应器，如毫升规模的搅拌罐生物反应器、微流体整合微型生物反应器，以及它们在QbD驱动下的高通量筛选中的可能实际应用进行了评价。

1  背景

高 通量培养技术被广泛应用于多种蛋白质的生产过程中，增加了人们对微生物及细胞在快速培养过程中行为的了解。高通量培养技术在近些年展现出快速发展的态势。 目前，大部分高通量培养技术主要通过缩小培养体积，过程中微型化在线监测，以及系统全自动化来实现的。反应器小型化是高通量培养过程实用、经济的主要因 素。如微孔板易于操作、成本低，这种类型的微型生物反应器目前已应用到许多领域，如哺乳动物细胞系监控、微生物蛋白表达重组子的筛选^①、代谢通路修饰研究、分子进化过程中产生的酶突变体的筛选等。但由于缺乏对过程中参数进行实时监控的技术手段，目前对MTP内部的培养条件还知之甚少。此外，利用该系统获得细胞生长状况的数据也是一件具有挑战性的工作。

生 物医药发展的最终目的是建立一个可持续的能够按照预期要求进行产品生产的工业过程。为了在医疗上实现产品的有效性与安全性，需要在研发早期和后续工业开发 过程中对生物医药过程有一个全面深入的了解，这样才能够识别生物过程中的关键要素并建立相应的过程设计空间。同时，在过去几年里，生物医药工业本身正面临 持续增加的经济压力和加速生物反应过程的问题，如何平衡好这两个因素很具有挑战性。生物系统的复杂性(如生产重组蛋白的新重组子)决定了寻找表达治疗性蛋白质的最佳培养条件是非常困难的。此外，药物创新成本高，商业化一个新蛋白质药物的周期大约是10年，因此尽量在药物开发早期找出能够保障质量和产量的最佳表达系统和相关过程参数，以确定由QbD驱动的生物发展过程的过程设计空间对于研究人员来说十分重要^②。这就是目前高通量培养技术在生物医药商业领域广受关注的原因。

基 因改造和分子生物学技术已经为构建能够生产具有疗效的蛋白表达系统提供了多种研究载体，如细菌、酵母、昆虫和哺乳动物表达系统，但尚没有仅依据目标蛋白本 身各种特性而选择最佳蛋白表达系统的标准。目前普遍采用“试错”的方式构建重组蛋白表达系统，即从尽量多可能存在的表达体系中筛选。即使在构建宿主细胞时 仅考虑大肠杆菌宿主，由于可供选择的载体、启动子、核糖体结合位点、信号肽和密码子偏好性具有多样性，很容易得到上千种组合。如此还不包括过程相关参数， 如培养温度、介质组成，以及补料和诱导方法等可能通过干扰蛋白质折叠、可溶性和表达水平而影响筛选结果的因素。由于筛选的目的是对菌株的生产能力进行排 序，需要把这些附加因素整合到高通量筛选系统中，这就会导致实验组和条件的进一步增加。构建菌株和后续筛选多通路组合的典型过程如图1所 示。解决筛选大量菌株困难的一个实际解决方案是增加克隆筛选培养阶段的通量。此外，高通量培养技术能够提供过程数据，即在生物过程早期能够使筛选菌株达到 预期质量的过程信息。理想状态下高通量培养数据能够直接用于构建降低规模的过程模型，甚至用于构建最终生产过程的设计空间。

图1  为获得最有效表达系统通过试错方式获得的大量重组文库

注：该高通量方法整合了三个过程参数，即温度、诱导浓度和培养基。该例中为构建最佳表达系统考虑了8个质粒、5个信号肽序列、3个候选目标分子，以及5个宿主菌的表型特征。

2  构建高通量培养及其应用的技术平台的策略

2.1  商业化高通量技术平台

为了处理大量用于表达治疗

性蛋白的不同克隆或研究新代谢通路，科研人员开发了大量高通量平台。然而在过去几年，仅有少量的技术被成功商业化。基于培养基混合机理，这些系统分为微型培养板(MTP)(0.2～4.0mL)，基于气升式或微孔板的小型生物反应器(1.0～10mL)，以及搅拌式微型生物反应器(≥10mL)。从生物反应过程监控能力(包括pH、DO、培养温度等)的角度来看，高通量平台可以分成以下4种。

(1)基于微型多孔板的生物反应器。这种反应器可以取代传统摇瓶，并且在通量上比摇瓶高出许多，如Duetz等设计的MicroFlask^③-⑥。

(2)多孔板培养。采用非侵入式手段，用光学传感器以平行、高通量的方式实时监控培养状况的生物反应器，如PreSens、SensorDishes和Biolector。

(3)多功能微型生物反应器。每个生物培养器有各自独立的气体供应、温度和pH调控。该系统是为了模拟搅拌式发酵罐而设计的，即24孔微型反应器或微型矩阵^⑦。

(4)一次性微型生物反应器。这种一次性反应器对于pH、温度、DO等参数具有封闭式循环控制，且为反应器参数设置、补料、加样等整合了一个自动液体处理单元。如TAPBiosystem的Ambr^TM工作站。

在选择高通量培养技术时必须仔细考虑平台硬件和培养特点。①需要考虑的因素是反应器间的变异系数(CV，%)， 从微型生物反应器到生物反应器，在细胞生长、代谢活性和产量上都需要考虑该参数。偏差程度反映了高通量技术平台的可重复性，该参数在筛选仅具有细小差异的 克隆时尤为重要。理论上讲，高通量培养的最大偏差应该小于所研究系统中能够检测到的变化。②需要考虑的因素是在资金投入允许下高通量平台能够承受的平行发 酵中的最大通量。③获取高通量系统的目的在于实现小规模高通量培养，因此需要提前考虑的因素包括对大量构建克隆的排序，加速锁定发酵参数范围以获得少量克 隆，或者加速针对于某个筛选克隆的生物过程优化^⑧。④需要考虑培养细胞本身的类型，如细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞，这些因素决定了生物过程的基本特质。

2.2  平行发酵技术平台

为了勾画出由QbD驱动的以高通量菌株筛选开始到大规模生产过程结束的生物过程的完整循环过程，必须在该背景下讨论平行发酵技术平台。作为生物医药过程QbD项目的一部分，美国FDA连续出台了一系列提高生物生产过程的相关规定，将关注重点从分析已经存在的代谢产物或药物成分转移到生产过程本身。越来越多的调控手段鼓励从事生物过程的公司在早期发展阶段引进过程分析技术(PAT)，从而对生物过程有更好的掌控，这就需要基于批量模型的多变元分析(MVA)^⑨。另一方面，从经济角度来讲，在研究早期通过高通量培养了解所选克隆的特性比后期了解这些更有利。实验室规模的平行发酵能够全方位模拟大规模发酵过程，达到上述目的。

平行发酵系统是一组由多个实验室规模的小型生物反应器及其调控系统、生物过程分析器、数据处理工具及试验设计策略(DoE)共同组成的系统(表1)。小型生物反应器的工作体积一般在50～1000mL。实验人员可以利用平行发酵系统的十多个高度配备的小型生物反应器，根据关键过程指标快速建立可重复、可扩大的实验过程。该技术的最大优势是能够为任何遗传改变的克隆(如重组微生物细胞、突变体、哺乳动物细胞、昆虫细胞等)设计实验。此外，能够根据识别关键过程属性以及它们之间的相互作用，在过程设计早期决定各种过程参数。

表1  成熟的平行培养系统基础特征总结

平台	Dasgip平行生物反应器系统(微生物/细胞培养)	MiniBio生物反应器	Multifors2/2cell
特征	·先进的过程控制能力，能进行70个过程参数的控制 ·适用于细菌、酵母、真菌、哺乳动物细胞的过程研究 ·有效的并可重现从小规模实验到快速放大过程 ·相互联系的平行生物反应器系统，可支持进行行业内领先的设计方案，如QbD、DoE和PAT，并可集成一些原有的控制系统 ·所有的控制系统可以同时进行一个或多个远程控制	·MiniBio系统有灵活的实验室规模的生物反应器 ·MiniBio系统可根据过程理论来自定义参数 ·短时间获得较多参数 ·容易设置和操作 ·培养过程使用更少的培养基 ·培养过程占用较少桌面空间 ·数据容易处理	·可用作细菌和哺乳细胞小体积的多重平行生物过程研究 ·设备包含的平行生物过程软件可对结果实现快速准确的统计学分析 ·可实现不同的培养策略，如分批培养、分批补料培养、连续培养 ·短时间获得较多参数 ·容易设置和操作 ·培养过程使用更少的培养基 ·培养过程占用较少桌面空间 ·数据容易处理
工作体积	60mL～4000L	250mL、500mL、1000mL	180～1000mL
备注	·结构与大型搅拌式生物反应器相似 ·单独的模块化设计使操作过程更灵活 ·小型的反应器之间可靠的可变控制	·系统可以自定义用来满足任何过程控制，这基于其每个反应器都有独立的控制单元。然而这可能引起反应器单元之间的差异 ·小体积流加 ·特殊设计的微量阀实现了小体积、精准、自动流加补料	·系统配备了工作体积为180～1000mL的反应器 ·工业标准的Pg13.5的螺口，可匹配通用的消泡、pH、DO等电极 ·可广泛用于过程研究
仪器维护成本	·仪器成本高 ·运行成本低 ·容易操作和维护	·仪器成本高 ·运行成本低 ·容易维护	·仪器成本高 ·运行成本低
相关网站	http://www.dasgip.com	http://www.applikon-bio.com	http://www.infors-ht.com

2.3  高通量培养策略

如何低成本、高效地实现从DNA到 稳定精确的生产过程的转变是当今生物过程研究者要考虑的主要问题。筛选出来的细胞最终还是在生产规模的生物反应器中进行培养，所以在筛选细胞株时希望是在 与生产条件相当的条件下进行。然而在设计过程中存在一个不可避免的悖论，当利用高通量筛选平台进行筛选时，随着通量的增加可控制的参数会相应的不可避免的 减少。由于技术发展的局限，目前缺少稳定的、在微型规模下能够对高通量过程进行实时监控的技术。因此，实际应用中，除考虑高通量平台本身的一些关键因素之 外还需要仔细对高通量培养策略进行评估。

2.4  克隆筛选培养物的高通量筛选策略

2.4.1  多轮筛选策略(图2策略I)

这里用重组蛋白表达系统作为一个例子来阐述如何选择高通量筛选平台及合适的筛选策略。如图1所示，一个DNA序列可以产生大量的构建体，这些构建体可以和质粒、信号肽、启动子、宿主细胞等排列组合构成大量的组合(如n≥1000)，然后通过“试错法”来选择最高效的表达菌株。考虑到筛选克隆文库非常庞大，第一步利用没有参数控制的培养筛选出阳性克隆以大大减少待选细胞，筛选出来的细胞可能包括或者不包括最优细胞，但肯定是优选细胞。由于MTP具有通量高、容易操作、经济实用等优点，其在高通量培养过程中是最适合的一项技术。这一轮的筛选可对细胞库中的细胞根据筛选标准[如单位生产率(蛋白量/生物量，g/g)、目标蛋白表达水平(滴度)]进行准确排序。在对克隆库进行排序的同时可以对一些重要过程参数(如温度、诱导剂浓度等)对过程的影响进行评估。第一轮筛选往往可以使目标克隆减少100倍，如减少到n≤10。

随后进行第二轮更加精确的筛选，如利用micro-24。 第二轮筛选的目的是为了筛选出最好的细胞克隆，其在生产过程能表现出较好的优势。微型反应器可以满足这一要求，并且一些过程参数也可以通过微型反应器获 得。然而，第二轮筛选出的最优菌株顺序可能与第一轮的不同，这主要是由于不同的培养环境对菌体的影响不同。另一个基本的策略是，由于没有一个普适性的发酵 流程适用于所有表达系统，对过程的优化完全依赖于外源蛋白的表达。因此第二轮筛选需要从优化筛选培养条件开始。这会显著增加第二轮筛选的工作量。目前国际 前沿的平行微型反应器，如micro-24或micro-Matrix，可以帮助解决这些问题。

图2  应用驱动的高通量培养策略及工作流程