胰岛素抵抗和糖代谢异常是II型 糖尿病的主要病理特征。机体在正常情况下通过胰岛素等相关激素能够非常精准地调控血液中的葡萄糖。伴随着能量摄入，升高的血糖水平会刺激胰岛β细胞分泌胰 岛素。血液中过量的葡萄糖被快速地转运至细胞内，从而使机体维持正常的血糖水平。胰岛素调控葡萄糖摄取主要是通过葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)从细胞内转位到质膜上来实现的。有关胰岛素是如何介导GLUT4转位和葡萄糖摄取的研究对于治疗糖尿病和发展疾病早期诊断方法具有重要的意义。本文综述了近年来在胰岛素信号调控下GLUT4转位方面的相关研究进展。
1 GLUT4与糖稳态调控
GLUT4是由SLC2A4基因编码的糖转运蛋白，能够以不依赖于ATP、协助运输的方式运送葡萄糖穿过细胞质膜。GLUT4具有12次跨膜蛋白结构域，广泛分布于骨骼肌和脂肪组织等胰岛素响应性组织中[1-2]。除了GLUT4外，这些组织还表达其他的一些糖转运蛋白，例如GLUT1。与其他糖转运蛋白不同的是，GLUT4在细胞内的分布受到胰岛素的调控。GLUT1等其他糖转运蛋白主要在基础状态(血糖水平低)下介导细胞对葡萄糖的摄取，而GLUT4在基础状态主要存在于胞内的各种膜结构中，只有少于5%的GLUT4位于细胞膜上。当机体进食后血糖水平快速升高，葡萄糖会促进胰岛素分泌增加。胰岛素促使GLUT4从胞内膜结构转移到细胞膜表面上，细胞表面上的GLUT4浓度在胰岛素的刺激下可以增加到其在基础状态时的5～30倍[3]。GLUT4通过摄取和清除血液中的葡萄糖来维持血糖平衡。当胰岛素浓度降低时，GLUT4通过胞吞作用回到细胞内，细胞表面的GLUT4重新恢复到基础状态时的水平。
GLUT4在机体糖稳态调控过程中发挥着重要作用，在II型糖尿病患者的脂肪组织中，GLUT4在mRNA和蛋白质表达水平上都有明显减少[4]。在小鼠模型中，GLUT4蛋白表达水平降低使小鼠产生胰岛素抵抗和糖尿病[5]。GLUT4在肌肉组织和脂肪组织中过量表达可以改善小鼠的血糖控制和糖耐受不良[6-7]。在细胞水平上，肌肉组织和脂肪组织中减少GLUT4的表达会引起肌肉细胞和脂肪细胞对葡萄糖的摄取减少并产生胰岛素抵抗[8]。
2 胰岛素调控GLUT4转位的信号通路
对于胰岛素调控骨骼肌和脂肪组织的葡萄糖摄取，目前研究者们认为主要是通过磷酸肌醇3激酶(PI3K)信号通路来实现的(图1)。胰岛素从胰岛β细胞分泌后，首先结合细胞表面上的跨膜胰岛素受体(IR)并激活胰岛素受体酪氨酸激酶。这会促使胰岛素受体底物蛋白(IRS)酪氨酸磷酸化，激活PI3K。PI3K与二磷酸肌醇(PIP2)发生作用，使PIP2转化为三磷酸肌醇(PIP3)[9]。PIP3的水平升高激活了含有PH结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶PDK1和mTORC2，并随后激活蛋白激酶AKT。
AKT有3个异构体，但是只有AKT2在胰岛素刺激GLUT4转运过程中起关键作用。George等[10]报道在胰岛素抵抗和糖尿病中发现了AKT2突变。AS160(又称为TBC1D4，分子量160 kD)是AKT2的一个重要底物，在脂肪和肌肉组织中过量表达AS160磷酸化位点突变体能抑制胰岛素依赖的GLUT4转位和葡萄糖摄取，敲除AS160和其类似功能蛋白TBC1D1，可显著减少胰岛素刺激的葡萄糖运输[11]。一份最新的报道发现格陵兰人近年来持续升高的II型糖尿病发生率正是由于AS160发生了突变。研究人员证实了在2575个调查个体中有17%的AS160等位基因存在p.Arg684Ter突变，同时伴随有胰岛素抵抗和血糖升高[12]。AS160含有一个GTP酶激活蛋白(GAP)结构域，其能特异地作用于G蛋白Rab。Rab是一类能促进囊泡运输的GTP结合蛋白，通过与GDP结合的失活状态向其活化状态转化来催化膜运输。作为一个负调控因子，AS160在基础状态下处于去磷酸化状态，能通过GTP酶将GTP转化成GDP。这使Rab蛋白处于失活状态，从而抑制了GLUT4囊泡在细胞内的运输。在胰岛素刺激下，AS160的五个氨基酸残基Ser318、Ser570、Ser588、Thr642和Ser751被AKT2磷酸化而丧失了GAP活性[13]，使Rab蛋白可以与GTP结合，促进GLUT4囊泡运输和GLUT4的膜转位。在基础状态下的脂肪细胞中敲低AS160的表达，会使部分GLUT4囊泡运输至细胞表面，从而增加了细胞表面的GLUT4水平[14]。Rab10是AS160一个重要下游结合Rab蛋白。在脂肪细胞中敲低Rab10的表达会抑制胰岛素引起的GLUT4转位。在敲低AS160的同时敲低Rab10则会减弱基础状态时由于AS160缺失所引起的表面GLUT4增多现象[15]。另外，文献报道的AS160的下游Rab蛋白除Rab10外，还有Rab8、Rab13和Rab14等[16-17]。
除PI3K信号通路外，胰岛素还能激活c-Cbl/CAP和G蛋白TC10通路(图1)。胰岛素受体酪氨酸激酶被激活后，原癌基因c-Cbl与Cbl复合蛋白(CAP)形成的复合物与另一个胰岛素受体底物蛋白APS结合，可以促使c-Cbl酪氨酸磷酸化[18]。磷酸化的c-Cbl/CAP复合物从胰岛素受体脱离并转移到脂筏区域，与蛋白CrkII和C3G作用。C3G激活Rho家族的小G蛋白TC10，TC10通过与其下游蛋白之间的相互作用来调控GLUT4的转位过程[1-2]。
图1 胰岛素调控GLUT4转运的分子机制
3 GLUT4的胞内循环与运输
受血糖水平和胰岛素浓度的影响，胰岛素响应组织通过胞吐和胞吞来调节GLUT4在胞内和细胞膜上的分布。研究胰岛素调控下GLUT4在细胞内各膜结构与质膜之间的穿梭过程对我们认识胰岛素功能有重要的意义。
在基础状态下，GLUT4主要分布在反式高尔基网、GLUT4囊泡等胞内区隔中，在内体中只检测到少量的GLUT4存在[19]。在胰岛素的刺激下，可检测到的GLUT4囊泡数量明显减少，而GLUT4在内体中的含量则迅速提高[20]。这说明GLUT4在这些胞内膜结构以及细胞质膜之间的循环受胰岛素信号的调控而不停地重新分布。在胰岛素信号消失后，大量的GLUT4通过分选过程从内体与质膜的循环中分离出来形成GLUT4囊泡或者通过内体逆向运输到反式高尔基网。反式高尔基网上的GLUT4会进一步的生成GLUT4囊泡滞留在细胞内从而脱离再循环。在胰岛素信号的刺激下，滞留的GLUT4囊泡迅速运动到细胞皮层，通过与质膜直接融合使GLUT4到达细胞表面[3]。
那么GLUT4囊泡是如何到达细胞皮层并拴系到细胞膜上的呢？有报道认为在脂肪组织中，大量存在的微管网络结构能通过驱动蛋白KIF5B运送GLUT4囊泡[21-22]。到达皮层附近的GLUT4囊泡通过一些大的多蛋白复合物或伸长的杆状分子将囊泡拴系到质膜上。Exocyst复合物是一个由八个亚蛋白(Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70和Exo84)组成的拴系分子，其中的四个亚蛋白含有伸长的杆状结构，将囊泡与质膜可以在相对远的距离下连接起来[23]。在3T3L-1脂肪细胞中过量表达Exo70突变体，能抑制胰岛素刺激的GLUT4上膜和葡萄糖摄取，但是并不影响GLUT4到质膜的运输[24]。电镜结果显示Exocyst可以形成一个“Y”形结构，“Y”形的每一端通过不同的小G蛋白(如Rab10、TC10、RalA等)与质膜和运输囊泡相互作用，将GLUT4囊泡拴系到细胞质膜上[23,25]。Exocyst的拴系作用只可以发生在约15 nm的距离内，所以人们相信肌动蛋白(actin)有可能是另一个在远距离下作用的拴系因子。在脂肪细胞中，肌动蛋白主要分布在细胞皮层附近，其聚合和稳定性影响胰岛素刺激下的GLUT4囊泡运输。GLUT4囊泡上的肌球蛋白马达MYO5和MYO1C可以结合肌动蛋白，通过肌动蛋白将GLUT4囊泡与质膜拴系在一起[3]。MYO5和MYO1C与小G蛋白(如Rab10、RAL等)也相互作用，这将肌动蛋白、Exocyst复合物、AS160与GLUT4囊泡联系在一起，它们之间的相互作用构成了胰岛素调控下的GLUT4囊泡运输与拴系网络[26]。
4 GLUT4的胞吐过程
胰岛素调控GLUT4转运的最后一个重要步骤是GLUT4的胞吐。GLUT4囊泡被拴系因子连接到质膜上后，通过蛋白质调控下的锚定和膜融合过程将GLUT4释放到细胞膜表面。与胰岛素分泌、神经递质释放等其他胞吐过程一样，GLUT4胞吐也需要其特定的可溶性N-乙基马来亚胺敏感蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE)蛋白以及 SM(Sec-l/Munc18)蛋白等SNARE调控因子的作用。通过全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescence microscope，TIRF)等方法发现膜融合是胰岛素作用于GLUT4转运的一个关键步骤[27]。一些SNARE调控蛋白如Munc18c、Synip等可以直接作为胰岛素信号作用的终端分子来调控GLUT4转位(图1)。近年来，有关胰岛素调控GLUT4胞吐的分子机制逐渐引起了人们的重视，研究GLUT4胞吐过程有可能为胰岛素抵抗和II型糖尿病治疗开辟新的药物作用靶点。
4.1 SNARE蛋白
GLUT4囊泡与质膜的融合过程需要通过SNARE蛋白来介导。膜融合是一个非自发的过程，需要外界提供一定的能量。位于质膜上的t-SNARE(target-SNARE)蛋白和GLUT4囊泡上的v-SNARE(vesicle-SNARE)蛋白可以自发地聚合，形成非常稳定的四螺旋束反式结构SNARE复合物，将两边的膜拉近并促使膜融合的发生。目前在脂肪和肌肉组织中发现了11种的t-SNARE和6种v-SNARE蛋白，但是只有Syntaxin-4(t-SNARE)、SNAP23 (t-SNARE)和VAMP2 (v-SNARE)三种蛋白参与GLUT4囊泡与细胞质膜的融合过程。Syntaxin-4和VAMP2各含有一个SNARE蛋白结构域，而SNAP23有两个SNARE结构域。体外重组实验显示，SNARE蛋白能够自发地促进不同膜结构的融合，从而也说明这一过程还需要其他蛋白的介入以抑制或激活SNARE蛋白的聚合。胰岛素信号通过调控SNARE与其结合蛋白的相互作用而达到对GLUT4囊泡与质膜融合过程的调控。
4.2 Munc18c
SM蛋白是一类调控膜融合的分子量为60～70 kD的亲水性蛋白。同SNARE蛋白一样，SM蛋白在膜融合过程中也是不可缺少的。所以也有学者认为SNARE蛋白复合物和SM蛋白是组成所有膜融合过程的最基本蛋白质机器[28]。Munc18c是参与GLUT4胞吐的主要SM蛋白[29]，最初对Munc18c功能的研究是通过在脂肪细胞中过量表达来进行的。研究者们发现Munc18c过量表达会抑制胰岛素刺激引起的GLUT4转运和葡萄糖摄取，因此Munc18c被认为是GLUT4转运的负调控因子。Munc18c可以与t-SNARE蛋白Syntaxin-4结合从而抑制Syntaxin-4与SNAP23和VAMP2形成复合物。随后的Munc18c基因敲低或敲除实验却证明Munc18c在胰岛素调控的GLUT4转运和葡萄糖摄取过程中是必不可少的[30]。体外实验也显示Munc18c能够通过有效地促进GLUT4囊泡相关SNARE复合物的形成来加快膜融合的速度[31]。一些学者认为Munc18c的表达水平会影响其在GLUT4转运中的功能，Munc18c表达量过高或过低都会引起不同程度的胰岛素抵抗[29]。
作为胰岛素受体的下游靶分子，Munc18c能以不依赖于PI3K信号通路的方式被胰岛素受体直接磷酸化[32]。酪氨酸残基Tyr219和Tyr521是在胰岛素的刺激下被磷酸化的两个位点[33]。Munc18c的磷酸化与Munc18c/Syntaxin-4的作用有关，磷酸化会促使Munc18c从Syntaxin-4解离。自由的Syntaxin-4与其他SNARE蛋白一起引发膜融合反应，而Munc18c通过促进SNARE复合物的形成将进一步调控GLUT4囊泡与质膜融合[31,33]。最近的一项研究也报道了胰岛素信号会促进Syntaxin-4相关SNARE复合物的形成，并且这一过程与胰岛素引发Munc18c磷酸化相关[34]。另外，有文献报道磷酸化的Munc18c是酪氨酸磷酸酶PTPIB的一个底物，PTPIB缺失会使Munc18c磷酸化水平升高和从Syntaxin-4解离[35]。
4.3 钙结合蛋白
胰岛素信号能通过氧化应激和三磷酸肌醇激活钙离子通道增加细胞质膜附近钙离子的浓度，并影响GLUT4的转位过程[36]。DOC2B(double C2-like domains beta)蛋白结合钙离子后与t-SNARE和带负电荷的磷脂作用，促进了SNARE复合物的形成[37]。DOC2B与SNARE蛋白的相互作用受胰岛素信号的调控。在脂肪细胞中通过RNA 干扰减少DOC2B的表达能够抑制胰岛素调控的葡萄糖摄取，胰岛素功能在DOC2B敲除的小鼠中也有明显减弱[38-39]。也有报道认为DOC2B可以调节Munc18c的功能。在胰岛素信号作用下，磷酸化的Munc18c蛋白从Syntaxin-4解离，与DOC2B结合在一起[40]。
Esytl(extended synaptotagmin like protein 1)具有五个C2结构域，其中有两个C2结构域可以结合钙离子。在胰岛素的刺激下，Esyt1能作为激酶CDK5的底物被磷酸化，并与GLUT4一起定位[41]。Esyt1在GLUT4转位中的作用还需要进一步验证。最近报道的另一个钙结合蛋白CDP138是Akt2的一个底物，敲低CDP138会抑制胰岛素引起的GLUT4转位和葡萄糖摄取。CDP138主要作用于GLUT4的胞吐，通过磷酸化S197位氨基酸和结合钙离子来实现其调控功能[42]。而CDP138和Esyt1是否与SNARE蛋白直接作用以及如何调控GLUT4膜融合还需要进一步的研究。
4.4 Synip和Tomosyn
Synip和Tomosyn是胰岛素调控GLUT4转位的两个负调控因子。作为Akt2的底物，Synip在基础状态时特异地结合Syntaxin-4和SNAP23，阻止锚定和膜融合的进行[43]。Akt2在胰岛素信号下磷酸化Synip释放Syntaxin-4，从而有利于SNARE复合物的形成、促进GLUT4转位[44]。Tomosyn是一个非特异性的GLUT4转位调控因子，除GLUT4转位外还可以调控许多膜融合过程，如胰岛素分泌、神经递质释放等。Tomosyn的C端有一小段类似v-SNARE结构的区域，可以有效地结合t-SNARE并抑制其与v-SNARE聚合。体内实验表明Tomosyn的调控作用不仅需要其C端v-SNARE结构域，还需要其N端WD40重复片段区域[45]。至于Tomosyn的功能如何受胰岛素的调控至今还是一个尚未解决的问题。
5 展望
糖尿病的发病原因至今尚未完全清楚。中国近几十年来糖尿病发病率持续升高，使糖尿病的治疗成为一个亟需解决的问题。II型糖尿病占糖尿病比例的90%左右，对胰岛素调控GLUT4转位的研究将有助于理解胰岛素抵抗的发生机制，并针对各个环节设计和筛选治疗糖尿病的药物。目前以调控GLUT4表达、胰岛素信号通路的各个环节为靶点，已成功发现了许多能够增强GLUT4转位并促进葡萄糖吸收的小分子化合物。随着GLUT4转位分子机制的深入研究，一些受胰岛素调控的关键蛋白将可能成为治疗胰岛素抵抗新的干涉位点。
目前对GLUT4转位的研究主要集中于胰岛素信号通路以及GLUT4胞吐过程中的调控等过程，而对GLUT4在细胞内的运输过程研究的较少。已有报道证明不同于GLUT4胞吐过程中的SNARE蛋白(如Syntaxin-6)、SM蛋白(如Vps45)和Rab蛋白(如Rab5)调控GLUT4在胞内膜系统中的运输和分选，GLUT4如何在细胞内运输以及胰岛素对这一复杂过程的调控将是未来GLUT4转运研究的一个重点。尽管目前对GLUT4转运的研究取得了很大的进展，但是与神经递质释放等胞吐过程的研究相比还有不小的距离，尤其是在已知调控因子的数量和作用机制方面。在基因和蛋白水平上对影响胰岛素调控GLUT4转运过程中参与蛋白的筛选将是一个十分重要的研究方向。另外，对于其他转运和胞吐过程中发现的相对保守蛋白如Munc13蛋白等是否参与GLUT4转运过程也需要进行重点研究。除RNA干扰外，TALEN、CRISPR/cas9等基因敲除和编辑技术的出现使科研人员能够快速、定向地实现基因水平上的精确修饰。这些高效的基因编辑技术结合TIRF、冷冻电镜等技术将给胰岛素对GLUT4转位的研究带来新的发展机遇。
参考文献：
[1]Huang S, Czech MP. The GLUT4 glucose transporter. Cell Metab,2007, 5(4): 237-252.
[2]Leto D, Saltiel AR. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(6):383-396.
[3]Stockli J, Fazakerley DJ, James DE. GLUT4 exocytosis. J Cell Sci,2011, 124(Pt 24):4147-4159.
[4] Kampmann U, Christensen B, Nielsen TS, et al. GLUT4 and UBC9protein expression is reduced in muscle from type 2 diabetic patients with severe insulin resistance. PLoS One, 2011, 6(11):e27854.
[5]Favaretto F, Milan G, Collin GB, et al. GLUT4 defects in adipose tissue are early signs of metabolic alterations in AlmslGT/GT, amouse model for obesity and insulin resistance. PLoS One, 2014,9(10):e109540.
[6]Koren-Gluzer M, Aviram M, Hayek T. Paraoxonase1 (PON1) reduces insulin resistance in mice fed a high-fat diet, and promotes GLUT4overexpression in myocytes, via the IRS-l/Akt pathway. Atherosclerosis, 2013, 229(1):71-78.
[7]Atkinson BJ, Griesel BA, King CD, et al. Mode rate CLUT4overexpression improves insulin sensitivity and fasting triglyceridemia in high-fat diet-fed transgenic mice. Diabetes, 2013, 62(7):2249-2258.
[8]Abel ED, Peroni O, Kim JK, et al. Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver. Nature, 2001,409(6821):729-733.
[9]Czech MP. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol, 2003, 65:791-815.
[10]George S, Rochford JJ, Wolfrum C, et al. A family with severe insulinresistance and diabetes due to a mutation in AKT2. Science, 2004,304(5675):1325-1328.
[11]Chadt A, Immisch A, de Wendt C, et al. Deletion of both rab-GTPase-activating proteins TBCIDI and TBCID4 in mice eliminates insulin-and AICAR-stimulated glucose transport. Diabeies.2014. (Epub ahead ofprint)
[12]Moltke I, Grarup N, Jørgensen ME, et al. A common Greenland c TBCID4 variant confers muscle insulin resistance and type 2 diabetes. Nature, 2014, 512(7513):190-193.
[13]Sano H, Kane S, Sano E, et al. Insulin-stimulated phosphorylation of a Rab GTPase-activating protein regulates GLUT4 translocation. J Biol Chem, 2003, 278(17):14599-14602.
[14]Brewer PD, Romenskaia I, Kanow MA, et al. Loss of AS160 Akt substrate causes Glut4 protein to accumulate in compartments that arc primed for fusion in basal adipocytes. J Biol Chem, 2011. 286(30):26287-26297.
[15]Sano H, Eguez L, Teruel MN, et al. Rabl0, a target of the AS160 Rab GAP, is required for insulin-stimulated translocation of GLUT4 to the adipocyte plasma membrane. Cell Metab, 2007, 5(4):293-303.
[l6]Sun Y, Bilan PJ, Liu Z, et al. Rab8A and Rab13 are activated by insulin and regulate GLUT4 translocation in muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(46):19909-19914.
[17]Chen Y, Wang Y, Zhang J, et al. Rabl0 and myosin-Va mediate insulin-stimulated GLUT4 storage vesicle translocation in adipocytes.J Cell Biol, 2012, 198(4):545-560.
[18]Ahn MY, Katsanakis KD, Bheda F, et al. Primary and essential role of the adaptor protein APS for recruitment of both c-Cbl and its associated protein CAP in insulin signaling. J Biol Chem, 2004,279(20):21526-21532.
[19]Shewan AM, van Dam EM, Martin S, et al. GLUT4 recycles via a trans-Golgi network (TGN) subdomain enriched in Syntaxins 6 and 16but not TGN38:involvement of an acidic targeting motif. Mol Biol Cell, 2003, 14(3):973-986.
[20]Blot V, McGraw TE. Use of quantitative immunofluorescence microscopy to study intracellular trafficking: studies of the GLUT4glucose transporter. Methods Mol Biol, 2008, 457:347-366.
